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Sviluppo ed applicazione in campo di una metodica diagnostica utile a identificare ruminanti infetti da virus erpetici a sostegno del piano di eradicazione della Rinotracheite Infettiva Bovina (IBR)

Development and application of diagnostic tests for Infectious Bovine Rhinotracheitis control

Tipologia
Progetti locali
Programma di ricerca
Progetti di “Ricerca Corrente 2012” Istitito Zooprofilattico Sperimentale di Piemonte, Liguria e Valle d'Aosta
Ente finanziatore
Ministero della Salute
Budget
13200
Periodo
02/01/2013 - 31/12/2015
Responsabile
Prof. Luigi Bertolotti

Partecipanti al progetto

Descrizione del progetto

Razionale

Bubaline Herpesvirus-1 (BuHV1) appartiene alla sottofamiglia Alphaherpesvirine, che comprende il Bovine Herpesvirus-1 (BoHV1), il Caprine herpesvirus-1 (CpHV1) e altri virus correlati. Il BuHV1 è responsabile di infezioni subcliniche del tratto respiratorio e genitale e provoca infezioni latenti che possono perpetuarsi per lungo tempo e costituire una fonte di infezione se riattivato: ciò è stato dimostrato per la prima volta nella bufala mediterranea a seguito di trattamento farmacologico immunosoppressore (De Carlo et al. 2004). Studi filogenetici hanno evidenziato una stretta somiglianza tra le sequenze di DNA di BoHV-1 e BuHV-1 che codificano per le proteine gB, gC e gD (Thiry et al. 2006). Considerata la stretta relazione tra i due virus esiste un certo grado di cross-reattività tra le glicoproteine strutturali. La percentuale di identità della sequenza nucleotidica per il gene della gB tra BoHV-1 e BuHV1 è superiore al 87% (Ros et al. 2002), mentre per i geni gC2 e gD non è disponibile in letteratura nessuna conoscenza (Keuser et al. 2006).

La diagnosi sierologica dell’infezione da BuHV1 può essere realizzata utilizzando la sieroneutralizzazione (SN). Il test di SN è considerato il gold standard e presenta un’elevata sensibilità, mentre la specificità può essere accertata in maniera crociata, essendo di 3-4 volte superiore il titolo verso il virus omologo messo a confronto con quello eterologo (Thiry et al. 2008). D’altra parte, il test di SN richiede tempo, laboratori attrezzati e qualificati per eseguirlo. Test ELISA competitivi verso la gB e la gE sono stati sviluppati per il BoHV1 e sono ampiamente utilizzati nel programma di eradicazione dell’IBR (Kramps et al. 2004). Il test ELISA gB consente di identificare l’infezione dei diversi herpesvirus ma non di differenziarle. L’ELISA gE invece è più specifico per i ruminanti infetti da BoHV1 e in risposta alle infezioni sostenute da CpHV1 e BuHV1 sia gli ospiti primari che gli ospiti secondari presentano un pattern prevalente di reattività gB+/gE-. Questo è stato dimostrato per il CpHV1 (Thiry et al. 2008) e BuHV-1 (Petrini et al. 2012). Va rilevato tuttavia che lo stesso pattern di reattività si ottiene in bovini vaccinati con vaccino marker, che pertanto risulterebbero non differenziabili. Le conoscenze sulla trasmissione interspecifica di CpHV1 e BuHV1 ai bovini risultano scarse e spesso limitate ad infezioni sperimentali. Tuttavia, se in seguito a contatti più o meno prolungati fra ruminanti di specie diverse, vi fosse passaggio di infezione, allora tali bovini risulterebbero gB+/gE- simulando la risposta verso un vaccino marker con implicazioni negli attuali piani di controllo per l’IBR. Quindi la realizzazione di un nuovo sistema diagnostico specifico, in grado di rilevare BuHV1 e CpHV1 con un basso livello di cross-reattività verso BoHV1 risulterebbe estremamente utile in alternativa alla più laboriosa SN crociata.

Essendo la gE, la glicoproteina più divergente tra tutti gli Alphaherpesvirus dei ruminanti, il progetto avrà lo scopo di caratterizzare la gE del BuHV1, fornendo l’intera sequenza dell’ectodominio e di valutare il potenziale diagnostico della sua forma ricombinante, espressa come proteina secreta in un vettore di espressione di mammifero. La ricerca prevede la realizzazione di un nuovo sistema diagnostico comparativo fra le infezioni sostenute da BoHV1, BuHV1 e CpHV1 e di valutare, in condizioni naturali eventuali trasmissioni interspecifiche. Verranno selezionati allevamenti aderenti al piano di controllo per IBR positivi e negativi e, inoltre, verranno testati allevamenti misti (bovini/caprini e bovini/bufalini) provenienti da differenti aree geografiche. Pertanto, oltre agli obiettivi di carattere diagnostico esposti in precedenza, il progetto si prefigge di stimare il livello di prevalenza di allevamenti infetti sul territorio piemontese e di descrivere il livello di infezione intra-allevamento in tutte le aziende incluse nel progetto.

Obiettivi e indicatori per la verifica dei risultati raggiunti

Il progetto permetterà:
1) la messa e punto e la standardizzazione di un protocollo diagnostico sierologico in grado di
differenziare le maggiori infezioni erpetiche dei ruminanti e di stabilire, per la prima volta, la prevalenza d’infezione da BuHV-1 negli allevamenti bufalini piemontesi, in un settore in costante crescita a livello regionale. Il raggiungimento di questi obiettivi, potrà fornire un determinante aiuto nel differenziare le infezioni erpetiche dei ruminanti a sostegno dei piani di eradicazione dell’IBR.
2) stimadellivellodiprevalenzadell'infezioneerpeticanegliallevamentioggettodistudio.
Nel raggiungimento dei precedenti obiettivi, saranno utilizzati i seguenti indicatori di risultato:
− divulgazione dei risultati dello studio alla comunità mediante pubblicazioni su riviste scientifiche, stesura di relazioni e presentazione dei dati a convegni nazionali e
internazionali mediante poster e comunicazioni orali.
− raggiungimento della numerosità campionaria (sieri) statisticamente significativa al fine
della messa a punto del Kit ELISA;
− completamento della raccolta dati ed individuazione delle caratteristiche dell'infezione
grazie alle quali svolgere lo studio epidemiologico;
− definizione dei livelli di precisione ed accuratezza del nuovo test in studio.

 

Risultati e pubblicazioni

Nogarol C, Bertolotti L, De Carlo E, Masoero L, Caruso C, Profiti M, Martucciello A, Galiero G, Cordioli P, Lelli D, Nardelli S, Ingravalle F, Rosati S. (2014) Expression and antigenic characterization of bubaline herpesvirus 1 (BuHV1) glycoprotein E and its potential application in the epidemiology and control of alphaherpesvirus infections in Mediterranean water buffalo. Journal of virological methods 207 16-21 [DOI  PMID]

 

Ultimo aggiornamento: 25/06/2015 16:31
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